3. Значення найпоширеніших молекулярно-генетичних методів

До найважливіших методів молекулярної генетики, що лежать в основі геномних технологій і ДНК-діагностики, належать: секвенування генів, полімеразна ланцюгова реакція, застосування генетичних маркерів тощо.

Винайдено британським ученим Фредеріком Сенгером у \(1977\) році. Велика швидкість секвенування, що стала доступною на початку \(ХХІ\) ст. завдяки новим технологіям, сприяла встановленню повної послідовності геному людини. Секвенування здійснюють за допомогою автоматичних секвенаторів, в яких застосовуються флуоресцентно-мічені праймери. Для кожного з чотирьох нуклеотидів беруть чотири різні флуоресцентні мітки, котрі випромінюють світло в різних спектральних діапазонах. Сканування гелю після електрофорезу лазерним променем, що збуджує флуоресценцію, дає змогу визначити різні нуклеотиди і прочитати послідовність.

Метод широко використовують у біологічній і медичній практиці для клонування генів, дослідження мутацій, виділення нових генів, створення генетично модифікованих організмів, діагностики захворювань, ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства тощо. Винахідних методу — американський біохімік К. Малліс так писав про нього: «Починаючи з єдиної молекули ДНК, носія генетичної інформації, ПЛР можу надати \(100\) мільярдів подібних молекул за декілька годин. Реакцію дуже легко провести, вона вимагає однієї тестової трубки, незначної кількості реагентів та джерела теплоти».

Молекулярно-генетичними маркерами можуть бути білки та ділянки ДНК у вигляді генів або коротких послідовностей нуклеотидів. На сьогодні генетичні маркери вже застосовуються в таких галузях діяльності людини, як криміналістика, біотехнологія, селекція, антропологія, генетична інженерія, медицина, спорт тощо. Так, у генеалогії для встановлення спорідненості по чоловічій лінії аналізують \(Y\) — хромосоми за допомогою STR-тестів. Для цього використовуються спеціальні ДНК-маркери, нуклеотидна послідовність у яких повторюється безліч разів — «короткі тандемні повтори» (англ. Short Tandem Repeats, STR). Оскільки \(Y\) — хромосома передається тільки від батька, то число повторів у маркерах сина буде таким самим, що й у його батька. У сільському господарстві STR-аналіз слугує для досліджень варіабельності геному та поліморфізму, що впливає на продуктивність сортів, у медицині існують маркери спадкових і онкологічних захворювань, у спорті — для визначення схильності спортсменів до занять певним видом спорту. У криміналістиці широко застосовується метод «генетичних відбитків пальців».

Суть методу ДНК-мікрочіп полягає в тому, що на спеціальній платі розташовується (за допомогою складного роботизованого механізму) велика кількість зондів — невеликих молекул ДНК, з якими взаємодіють молекули РНК, що наявні у досліджуваних клітинах. Зондами можуть бути гени як усього геному (на одній скляній платі їх можна розмістити до \(40\) тисяч), так і певної його частини, яка задіяна у дослідженні. Місце кожного із зондів на платі чітко визначено, що є дуже важливим для здійснення аналізу взаємодії молекул РНК із зондами, бо такий аналіз здійснюється автоматично за допомогою спеціального пристрою.

Усі РНК досліджуваних клітин мітять спеціальними сигнальними молекулами, які забезпечують їхнє забарвлення. Якщо досліджувані клітини зруйнувати і вилити отриманий розчин на поверхню плати, то всі РНК будуть взаємодіяти із зондами, що їм відповідають. Після промивання плати, коли всі зайві молекули будуть видалені, лазерний детектор легко знайде сигнальні молекули, що прикріплені до молекул РНК, які зчепилися із зондами відповідних генів, і можна буде визначити, які гени в клітинах працювали.

 

 

Така технологія дозволяє, наприклад, з'ясувати, які гени в раковій клітині працюють, а які ні, порівняно зі здоровою, або які саме гени перестають працювати або змінюють свою активність у разі певного спадкового захворювання.